陆地棉矮秆突变体的转录组和小RNA测序分析

【摘要】棉花是我国重要的经济作物之一,矮化棉花具有强的抗倒伏能力和群体光能利用率,早熟及适合高度密植等特点。因此,合理利用棉花自身的矮秆性状,从遗传的角度控制棉花株高,选育出株高适当、株型理想的矮化品种,是棉花矮化育种的一项重要目标。本实验利用新一代高通量测序技术,对陆地棉矮化突变体Ari1327、高秆突变体Ari3697及其野生型Ari971进行了转录组和小RNA深度测序,通过转录组水平和miRNA调控水平的全面分析,以期在分子水平上解释Ari1327的矮化机理,为棉花矮化基因的克隆以及矮化育种提供理论依据和丰富资源。通过测序及后续的数据分析验证,我们得到的主要研究结论如下：(1)通过IlluminaHiSeqTM2000系统对三个材料5叶期的茎尖进行转录组测序,预处理去除低质量片段后,共得到52583550条有效reads。对有效reads进行Denovo拼接,得到了156848个长度大于200bp的转录本,最终获得70877个Unigene。(2)通过Ari1327与Ari971和Ari3697两个文库的差异筛选,共得到13919个与矮化相关的差异表达基因,其中5406个在矮秆突变体中上调,8513个表现下调。GO功能和KEGG通路富集发现,矮化相关的差异表达基因在植物激素信号转导途径显著富集,其中富集在赤霉素和生长素途径上的基因最多。(3)通过荧光定量对16个植物激素信号转导途径上的基因进行分析,与转录组测序得到的表达趋势一致,验证了测序结果的可靠性和一些重要基因的表达趋势变化。(4)通过对3个样本的小RNA高通量测序分析,共得到226个保守的miRNA,分布在32个已知家族当中,其中鉴定到20个已知的陆地棉miRNA。经严格的软件预测分析,共得到19个新的miRNA。以转录组数据为对象,发现miR858b通过负调控MYB的转录,调控与之相关的激素信号途径。对保守的miRNA进行靶基因预测,226个保守miRNA共预测得到531个靶基因,这些靶基因注释上436个GO和116个pathway。小RNA与转录组数据联合分析,发现miR858b通过负调控MYB的转录,调控与之相关的激素信号途径。(5)通过miRNA表达量的差异分析,共得到18个同时在Ari1327和Ari3697中差异表达的miRNA家族。其中16个家族在Ari1327中均上调表达,而且同时在Ari3697中下调表达。将3个小RNA文库得到的保守miRNA取交集,得到了25个在Ari1327中特异表达、13个在Ari3697中特异表达的miRNA。这16个miRNA家族和38个特异表达的miRNA可能对Ari1327的株高具有重要的调控作用。(6)将Ari1327和Ari3697与野生型Ari971分别做miRNA差异表达分析,得到在Ari1327和Ari3697中差异表达的miRNA。将这些差异表达niRNA的靶基因在棉花A、D基因组上进行注释,将靶基因定位在棉花A、D基因组染色体上。Ari1327与Ari971差异miRNA的靶基因集中在12号染色体上,Ari3697与Ari971差异miRNA的靶基因集中在9号染色体上。(7)利用茎环荧光定量的方法对7个miRNA进行验证分析,与测序得到的结果基本一致,证明Stem-loop荧光定量法对miRNA的检测可以用来验证测序结果的可靠性。同时也对两个miRNA的靶标进行了荧光定量验证,得到了与转录组测序一致的结果。通过对3个样本进行转录组及小RNA的测序分析,我们得到了大量的有用信息,虽然有些基因未得到相应的注释,但是两个调控水平上的测序结果对后续的分析和研究都有很大的利用价值。两种植物激素赤霉素和生长素可能在Ari1327的矮化中起到重要作用,由于目前对激素与miRNA之间关系的研究很有限,因此Ari1327中相对应的可能调控这两种激素的miRNA还需要进一步的挖掘和验证。
【作者】安文燕；
【导师】杜雄明；
【作者基本信息】华中农业大学，遗传学，2014，硕士
【关键词】棉花；矮秆突变体；转录组测序；小RNA测序；实时荧光定量PCR；

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